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Western Blot一做就是一天半,有个方法帮你 3 小时搞定
[ 发布日期:2023-5-8 13:36:16    阅读次数:152 ]
 
Western Blot(WB)被称为科研人心中的「噩梦」实验,为什么这么说呢?
首先,WB操作步骤繁杂,实验流程长。从蛋白提取、制胶、电泳、转膜、抗体孵育到成像,每个流程都相当耗时。特别是抗体孵育,还需要过夜。
其次,WB实验结果受太多人为因素的影响。比如,制胶拔梳子太快,胶被弄裂;转膜「三明治」叠放顺序出错,导致转膜失败......
最让人烦恼的一点,WB实验的重复性和稳定性不佳。学术新闻里常常能看到SCI 文章由于WB实验无法重复而撤稿。
望着我的实验记录本,满满的失败数据和注意事项。眼看着离心管里来之不易的蛋白样本就要见底,难道真的没有更简单更可靠的WB实验方法了吗?

图片来源:丁香实验
科研人员为了简化WB实验的流程,一直在对其进行优化。近年,兴起了一种新的蛋白检测技术--全自动蛋白质表达定量分析(Automatic Quantitative Protein Analysis)。它将传统 WB 的制胶、蛋白电泳分离、杂交和成像集成到一个系统中,并实现全自动化。它因为步骤简单,也被叫做全自动毛细管Digital Western系统(也称Simple Western)。
Digital Western一经问世,便深受科研人的喜爱,它不光节省样本,而且大大节省了操作时间,它精确的数据分析能力帮助科研人得到更准确的实验结果。
顶级杂志Neuron(五年平均 IF = 18.65)2019 年发表的一篇文章中, Digital Western被用于微量中脑组织和原代神经元细胞蛋白质表达分析。作者仅用了 0.2μg总蛋白就得到实验结果,这只是传统WB所需蛋白量的几十分之一。

图片来源:Neuron
Nature Communications(五年平均IF = 15.81)发表了一篇有关肿瘤细胞信号通路研究的论文,也用了Digital Western 系统来检测蛋白。在该系统中,所用抗体在正确的波段显示后才被正式使用到实验里。通过该系统自动化的数据分析,实验者对蛋白进行了有效定量,确定了每个样本中目标蛋白的绝对值,使实验结果更可信,更精准。

图片来源:Nature Communications
这些证据也许还不足以证明Digital Western的优势,我们不免还是抱有怀疑:Digital Western真的有这么厉害吗?为此,有研究人员专门对比了Digital Western 系统和传统 WB 两种蛋白定量分析方法的灵敏度、重复性和适用范围[3]。结果表明相比于传统 WB :
 Digital Western 无需制胶、无需转膜,安全环保
 3 小时左右获得结果,缩短实验优化时间
 全自动化,无需值守,效率更高,可进行多重检测
 可以检测低至 0.5 μg 左右的蛋白量,对于来源不易的样本,更节省样品
 实验流程标准化,具有可重复性
 分子量可跨度 2~440 KD
当目标蛋白分子量差异较大时,可以用Digital Western系统同时检测目标分子和内参。

图注:采用Digital Western同时检测两种蛋白。(A) 同时检测内参(GAPDH 或 Actin)和目的蛋白Ku70的泳道图;(B) 同时检测GAPDH和目的蛋白 Ku70 的峰形图;(C) 同时检测Actin和目的蛋白Ku70的峰形图。
其实,国内外目前已经有许多高分文献应用 Digital Western 技术检测蛋白,WB 正在经历着前所未有的技术革新。StellarTM 超灵敏荧光检测试剂盒,搭载在全自动多功能超灵敏荧光Western蛋白质分析平台Jess上(Digital Western),能为科研人提供自动化高灵敏荧光免疫蛋白检测技术解决方案。优势如下:

图注:ProteinSimple超灵敏荧光检测试剂盒 StellarTM
 多通道,可以在同一个泳道对不同蛋白多重检测;

图注:Stellar NIR和IR荧光多重检测的AKT总/磷蛋白。StellarTM NIR / IR通道能够在同一泳道中多重检测总AKT和磷酸化AKT,并具有出色的重现性(24个泳道: pAKT < 10% CVs和Total AKT < 5% CVs)。
 微量样品,3小时获得结果,定量准,重复性高;

图注:StellarTM 荧光检测的灵敏度通过DNA与检测抗体相连的多个信号放大步骤实现。
➣ 简单高效对细胞信号通路研究中磷酸化蛋白进行检测
➣ 全程追踪记录,原始数据不可纂改,解决传统 WB 图片误用造假问题
➣ 总蛋白质含量归一化分析,可以比较蛋白质上样量
➣ 与对照样品归一化处理,比使用内参蛋白更可靠,增加数据说服力
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内容策划:王丹琦
内容审核:朱超敏
题图来源:图虫创意

参考文献:
[1]. Back S., Necarsulme J., Whitaker L.R., et al., Neuron-Specifific Genome Modifification in the Adult Rat Brain Using CRISPR-Cas9 Transgenic Rats. Neuron , 2019, 102: 105–119.
[2]. Ilyas Chachoua, Ilias Tzelepis, Hao Dai, et al., Canonical WNT signaling-dependent gating of MYC requires a noncanonical CTCF function at a distal binding site. NATURE COMMUNICATIONS, 2022,13: 204.
[3]. 雷虹, 胡峰瑞, 陈妍珂, 苟兴春. 蛋白免疫印迹和全自动蛋白质定量分析的比较研究[J]. 生物医学, 2021, 11(2): 113-119.

详细请点击链接查看:mp.weixin.qq.com/s

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